L’étude du glycoside de Kaempférol comme insuline mimique révèle que Glycon est la principale structure active

L’insuline, un peptide sécrété par β -Cellules situées dans les îlots pancréatiques de Langerhans, est l’hormone responsable de la réduction du taux de glucose dans le sang pour maintenir l’homéostasie. L’altération de la sécrétion d’insuline et la résistance à l’activité de l’insuline sont toutes deux liées au développement du diabète sucré, une maladie de plus en plus répandue dans le monde1. L’hyperglycémie chronique est la cause d’une hyperglycémie chronique. β -cells (type 1 DM) ou par diminution de la sensibilité à l’insuline, souvent accompagnée d’obésité (type 2 DM). Bien que la cause sous-jacente de la maladie puisse varier, le traitement des deux types de DM est axé sur le contrôle de la glycémie. Les stratégies thérapeutiques actuelles ciblées sur l’action de l’insuline comprennent l’utilisation d’insuline exogène pour abaisser les niveaux de glucose dans le sang; une sulfonylurée, un inhibiteur de dipeptidylpeptidase-4, un analogue de peptide-1 de type glucagon pour améliorer la sécrétion d’insuline; et un agoniste des récepteurs activés par les proliférateurs peroxysomaux (PPAR) pour lutter contre la résistance à l’insuline.2 − 6 Tous ces médicaments agissent pour améliorer les symptômes de la DM, mais aucun d’eux, à l’exception de l’insuline elle-même, ne travaille directement sur les cellules somatiques pour réguler l’absorption de glucose dans le sang. Ainsi, dans le diabète de type 2 insulinorésistant, il existe un besoin continu de traitements pharmacologiques pour réduire les niveaux de glucose sanguin. Dans un effort pour surmonter ce déficit, un certain nombre de rapports récents décrivent des substances qui stimulent directement les cellules. augmenter l’absorption du glucose et diminuer les niveaux de glucose dans le sang. Les oligo-éléments essentiels, le vanadium (ou ses complexes) et le zinc, sont tous deux connus pour fonctionner de cette manière7. Cependant, le risque d’effets secondaires tels que l’intoxication par les métaux empêche l’estimation précise d’un dosage approprié et empêche leur utilisation comme une nouvelle thérapie pour DM. Outre les métaux, certains composés organiques naturels, notamment les flavonoïdes et leurs glycosides, améliorent également l’absorption du glucose10. Bien que la plupart des flavonoïdes signalés soient des agonistes des PPAR qui renforcent l’activité de l’insuline, le kaempférol 3-O-néohespéridoside (1) isolé de Cyathea phalerata Mart. a été rapporté pour présenter une activité semblable à l’insuline et est donc une mimétique de l’insuline potentielle. La structure flavonoïde de 1 est similaire à un flavonoïde rapporté précédemment comme un agoniste de PPAR. Cependant, l’activité insuline-mimétique est unique à 1 et n’a été rapportée dans aucun des autres flavonoïdes. Dans cet article, nous étudions la composante moléculaire responsable de cette activité unique de 1. Nous avons synthétisé 1 et plusieurs composés apparentés contenant des substructures de 1 et testé leur activité dans des cellules cultivées. La synthèse de 1 n’a pas été rapportée précédemment. Ainsi, nous avons suivi la procédure de synthèse pour les composés apparentés qui implique la réaction du bromure de néohespéridyle (7) avec un flavonol (14) 15. Le 2 commercialement disponible a été soumis à la désacétylation et à la benzylation ultérieure pour donner 3. La double liaison de 3 a ensuite été oxydée par diméthyldioxirane (DMDO) pour former un α -époxyde, qui a été sélectivement ouvert par une addition d’acide acétique pour former 4.16,17 Ce glucose protégé sélectivement (4) a ensuite été mis à réagir avec l’imidate de rhamnose (5) en présence de TMSOTf comme catalyseur18. Le composé résultant (6) a été bromé diastéréosélectivement dans une solution de HBr / acide acétique pour donner 7 (Schéma 1). Le flavonol (14) a ensuite été synthétisé par un procédé précédemment utilisé à partir de 8.19 Après avoir protégé deux groupes hydroxyle de 8, le 9 résultant a été soumis à la condensation d’aldol avec 10. Une cyclisation subséquente en présence d’une quantité catalytique d’iode a donné La flavone (12) a ensuite été oxydée en utilisant DMDO, qui a ajouté un groupe hydroxyle en position 3-C pour donner 13. Bien que 13 ait une structure adaptable pour la synthèse de 1, une réaction de glycosylation avec 7 n’a pas eu lieu. Nous soupçonnons que la liaison hydrogène entre le groupe 3-OH et le groupe carbonyle interfère avec la réaction. Ainsi, le groupe protecteur de benzyle de 5-OH a été sélectivement éliminé par chauffage dans une solution aqueuse d’acide acétique pour donner le composé 14 (Schéma 2). Le flavonol (14) a ensuite été couplé avec 7 dans une solution biphasique CHCl3-eau avec du K2C03 comme base et du bromure de tétrabutylammonium (TBAB) comme catalyseur de transfert de phase pour donner 15 avec un rendement de 47%. Finalement, les groupes acétyle et benzyle de 15 ont ensuite été éliminés pour donner 1 (rendement global de 7%) (schéma 3). 20Schéma 1Synthèse du bromure de néohespéridyle (7) Schéma 2Synthèse du flavonol (14) Schéma 3Synthèse du kaempférol 3-O-néohespéridoside (1) Le rapport précédent sur les propriétés insulinomimétiques d’un segment de muscle de rat utilisé pour tester son activité.14 Pour évaluer l’activité d’un grand nombre de composés, nous avons besoin d’un débit et d’une reproductibilité améliorés. . Les lignées cellulaires cultivées répondent à ces exigences, et une lignée cellulaire de modèle musculaire, L6, a été sélectionnée pour tester les composés générés dans notre étude. L’activité insuline-mimétique a été mesurée en quantifiant l’absorption de glucose promue par chaque composé échantillon, en utilisant du 2-désoxyglucose (2-DG) comme substitut de glucose non métabolique. La quantité de 2-DG transportée a été quantifiée par la méthode enzymatique rapportée par Yamamoto et coll.21,22 Synthetic 1 a montré une activité insuline-mimétique et favorisé l’absorption de 2-DG, avec une absorption de pic observée à une concentration de 1 nM (Figure ​ (Figure1) .1). À cette concentration, 1 a montré une amélioration de plus de 200% de l’absorption de 2-DG par rapport aux cellules témoins. Des concentrations plus élevées et plus faibles de 1 ont montré une activité plus faible, et l’absorption de 2-DG a même diminué par rapport au témoin à une concentration de 1 mM. Certaines données suggèrent que la fraction flavonoïde pourrait être responsable de cette diminution de l’absorption. En cas d’exposition chronique (plusieurs jours), certains flavonoïdes améliorent l’absorption du glucose.10 − 13 Cependant, dans le cas d’une exposition plus aiguë (en général quelques heures), certains types de flavonoïdes (dont le kaempférol) inhibent l’absorption du glucose .23 Ainsi, il peut y avoir un conflit intramoléculaire dans 1 où différentes fractions ont des effets opposés, et à forte concentration, l’effet de la fraction inhibitrice peut devenir prédominant. En variante, il est possible que l’inhibition d’un transporteur de glucose puisse expliquer la diminution observée de l’absorption de 2-DG, car 1 contient une fraction glucoselike dans sa structure. La dépendance de concentration de l’activité de 1 suit le résultat de Zanatta et al., Indiquant la validité de l’utilisation de modèles cellulaires cultivés pour évaluer l’activité insuline-mimétique.14 Figure 1 Activité insuline-mimétique de 1 à diverses concentrations. Les cellules L6 différenciées ont été traitées avec les concentrations indiquées de 1 pendant 4 heures. Les cellules témoins ont été incubées sans échantillon; 100 nM d’insuline ont été utilisés comme témoin positif. Après incubation, … Pour identifier l’unité structurale responsable de l’activité de 1, nous avons ensuite synthétisé et testé plusieurs composés représentant diverses substructures de 1. Kaempférol (17), kaempférol 3-O-glucoside (18) et néohespéridose (19 ) sont les principaux éléments structuraux de 1 donc ont été principalement sélectionnés pour le dépistage. Le Kaempférol (17) et le néohespéridose (19) ont été facilement obtenus par déprotection des groupes benzyle et acétyle dans les intermédiaires de synthèse 13 et 6, respectivement. Le 3-O-glucoside de Kaempférol (18) a été synthétisé en fixant le glucose à 14, suivi de l’élimination des groupes protecteurs (Schéma 4). L’activité insuline-mimétique de ces composés synthétiques est résumée dans la figure ​ Comme mentionné ci-dessus, on rapporte que de nombreux flavonoïdes ou plantes contenant des flavonoïdes présentent une activité antidiabétique. Nous avons émis l’hypothèse que le composé aglycone 17 pourrait être responsable de l’activité de 1. De manière inattendue, comme le montre la figure 2, le kaempférol (17) et son 3-glucoside (18) ont montré une activité négligeable. De façon inattendue, la principale sous-structure responsable de l’activité insuline-mimétique semble être le néohespéridose (19). Ce composé induit une augmentation de 250% de l’absorption de 2-DG par rapport aux cellules témoins à des concentrations de 0,1 et 1 nM. De plus, 19 ont montré l’activité la plus élevée à 0,1 nM, une concentration 10 fois plus faible que la dose la plus efficace de 1 (Figure ​ (Figure2) .2). Une liaison glycosidique avec l’énol est relativement faible et peut être facilement hydrolysée dans des milieux aqueux ou par une glycosidase intracellulaire endogène. La puissance 10 fois plus faible de 1 pourrait s’expliquer par l’hydrolyse de ∼ 10% de 1 par rapport au produit actif, 19. Nous n’avons actuellement aucune information pour confirmer ou réfuter que 1 nécessite une hydrolyse pour devenir active.Figure 2Insulin- activité mimétique des composés synthétiques. Les cellules L6 différenciées ont été traitées pendant 4 h avec des concentrations de 0,1 ou 1,0 nM des composés indiqués. Les cellules témoins ont été incubées soit sans échantillon (témoin négatif) soit avec une insuline de 100 nM. Nous considérons que le disaccharide est la structure clé de l’activité insuline-mimétique. Le contrôle de l’absorption du glucose dans la cellule musculaire par le disaccharide (c’est-à-dire le sucre) est peut-être intuitif, mais, à notre connaissance, ceci est un nouvel aperçu de la fonction de ce disaccharide. On rapporte que des dérivés d’inositol structurellement analogues miment l’activité de l’insuline et favorisent l’absorption du glucose dans les cellules L6 et le muscle du rat24,25. L’activité apparente de ces dérivés de l’inositol est équivalente à l’insuline, mais leur mécanisme semble être divergent. Bien que 19 soit considérablement plus puissant que les dérivés de l’inositol (étant actif aux concentrations subnanomolaires, 106 fois plus faible que les dérivés de l’inositol), 19 présente des similitudes structurales avec l’inositol et peut donc avoir un mécanisme d’action similaire. D’autres études structurales, mécanistiques et pharmacocinétiques sur le disaccharide actif peuvent aider à développer et à optimiser un nouveau traitement pour le DM. En conclusion, nous avons synthétisé pour la première fois un modèle de test pratique utilisant des cellules L6 cultivées pour examiner son insuline. activité mimétique. Nous avons déterminé que la sous-structure responsable de cette activité est le néohespéridose (19). La structure disaccharidique clé responsable de cette activité unique distingue 1 des autres flavonoïdes connus pour améliorer l’hyperglycémie. À notre connaissance, il s’agit de la première preuve d’une absorption de glucose cellulaire par des disaccharides et peut représenter une nouvelle stratégie dans le développement de nouveaux traitements pour le DM. Des questions subsistent quant au mécanisme d’action de 19 dans les cellules musculaires et à l’existence possible d’autres disaccharides bioactifs. Nous étudions actuellement la structure des disaccharides et les relations d’activité pour répondre à ces questions.