Nouvelle infection à poxvirus chez un patient immunodéprimé

Contexte On décrit de plus en plus souvent des infections poxvirales humaines et animales. Nous décrivons un cas difficile et un traitement d’une éruption poxvirale auparavant inconnue chez un patient ayant subi une transplantation rénale. Une combinaison de techniques classiques de microbiologie, y compris la culture virale et la microscopie électronique, a été utilisée. Rétrospectivement, les méthodes de séquençage de nouvelle génération ont été utilisées pour fournir le diagnostic définitif d’une nouvelle infection à poxvirus initialement identifiée par microscopie électronique. Ce poxvirus, identifié en Amérique du Nord, est un poxvirus recueilli à partir d’un pool de moustiques d’Afrique centrale. Conclusions Ce problème diagnostique a finalement été résolu en utilisant le séquençage d’ADN de prochaine génération. Cet article décrit l’utilisation de cl Stratégies diagnostiques cliniques et de la prochaine génération pour identifier les agents étiologiques des maladies infectieuses émergentes et démontrer une fois de plus la sensibilité des patients immunosupprimés à de nouveaux agents pathogènes Le virus identifié est étroitement apparenté au virus Yoka; ces virus semblent avoir divergé indépendamment d’un ancêtre commun de tous les orthopoxvirus connus

poxvirus, immunosuppression, pathologie: un homme de race blanche âgé de plus de 3 ans présentant une allogreffe rénale stable et hospitalisé avec une histoire d’éruption cutanée sur la poitrine latérale droite devenue progressivement plus tendre, érythémateuse et indurée Trois semaines auparavant, le patient a noté une lésion de type blister dans son aisselle Aucune fièvre ou frissons n’ont été signalés, et il a été admis pour des antibiotiques intraveineux avec un diagnostic de cellulite L’érythème et l’induration s’aggravaient, et une ulcération apparaissait sur le flanc droit Une incision et un drainage du flanc droit « Abcès » a été tenté Petit pus a été obtenu, et les cultures bactériennes et fongiques ont échoué à développer tout organisme causal Ses antibiotiques ont été modifiés sans amélioration notée Le jour où il a été transféré à l’hôpital régional tertiaire Il est resté afebrile avec un globule blanc normal Les antécédents médicaux du patient étaient significatifs pour l’insuffisance rénale terminale secondaire au syndrome d’Alport et la vivre des reins de donneurs non apparentés des mois plus tôt; autres antécédents d’hypertension artérielle, hyperparathyroïdie, hypercholestérolémie et surdité Les antécédents chirurgicaux comprenaient la parathyroïdectomie, les hémoaccess, la réparation des fentes labiales et la chirurgie orthopédique de l’avant-bras gauche. Le patient a été traité par mycophénolate mofétil, cyclosporine, prednisone, lansoprazole, térazosine, métoprolol, diltiazem, simvastatine, furosémide et chlorure de potassiumL’examen physique à l’établissement de soins tertiaires a révélé une zone d’agrandissement d’un érythème de plus de 1 cm. Les zones rouges et indurées ont évolué vers un rose plus pâle et se sont étendues latéralement vers le ligament inguinal. Figure A accompagnée d’une lymphadénopathie axillaire droite Six jours après le transfert à l’établissement de soins tertiaires, de nouvelles lésions vésiculo-vertébrales ont été observées. Figure B Des débridements multiples ont été effectués au cours de l’hospitalisation et soumis à un examen anatomopathologique. dense Infiltrat inflammatoire composé de lymphocytes, histiocytes et éosinophiles focaux se prolongeant dans le tissu adipeux sous-cutané Aucun signe de virus herpès simplex ou virus varicelle-zona VZV avec coloration immunohistochimique Les colorations spéciales pour les organismes acido-rapides et fongiques étaient négatives Les inclusions virales définitives n’étaient pas reconnues voir ci-dessous; les caractéristiques ont été jugées cohérentes avec la panniculite éosinophile Un cas de panniculite éosinophile associé à une polyartérite noueuse ayant été traité avec du cytoxan et des corticostéroïdes , le patient a été soumis à un corticostéroïde à pouls initié le jour de l’hospitalisation. Oxygénothérapie hyperbare postopératoire Trois jours après l’administration de corticoïdes, le patient a développé des vésicules prurigineuses supplémentaires sur son flanc droit et ses extrémités bilatérales. Similaire à la figure B, ces vésicules étaient de couleur beige, rondes, ombiliquées et d’environ – mm de diamètre. environ mm, à sommet plat, et rempli d’un matériau épais de couleur crème Famciclovir a été commencé à traiter une infection présumée VZV Au cours des prochains jours, le nombre de vésicules a augmenté considérablement et coalesced; le patient est devenu fébrile jusqu’à C et a développé une leucocytose pour la première fois

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveA, photographie du patient, montrant une lésion ulcéreuse importante du flanc droit, après débridements B, image d’une lésion apparue quelques jours après que le patient a consulté pour la première fois à l’hôpital extérieur, jours après l’hospitalisation à l’hôpital tertiaire et jours après la première notation d’un blister sous le brasFigure Vue largeDownload slideA, photographie du patient, montrant une lésion ulcérative importante impliquant le flanc droit, après des débridements B, image d’une lésion apparue quelques jours après que le patient a consulté pour la première fois l’hospitalisation à l’hôpital tertiaire, et quelques jours après la première notation d’un blister sous l’hôpital. Un premier débridement a été effectué et des cellules épithéliales HEp ont été inoculées avec un extrait tissulaire. Les cellules Hep ont manifesté un effet cytopathogène viral CPE et ont réagi anticorps anti-entérovirus mais pas avec anticorps spécifiques de l’espèce Microscopie électronique à section mince Les Centres de Contrôle et de Prévention des Maladies CDC ont été contactés pour identifier le virus et les options thérapeutiques. Les échantillons envoyés aux CDC ont produit des CPE dans les cellules BSC, mais les EM ont montré des inclusions intracytoplasmiques contenant de nombreuses formes matures et en développement. Les amorces de PCR ciblant l’hémagglutinine ou les gènes des protéines du corps d’inclusion de type A utilisées pour identifier les orthopoxvirus nord-américains et eurasiens. L’examen de l’histopathologie de la biopsie a révélé des inclusions cytoplasmiques roses denses, typiques pour les corps de Guarneri Figure Comme le virus n’a pas pu être identifié comme un orthopoxvirus, l’immunoglobuline de la vaccine n’a pas été recommandée, et l’équipe de transplantation rénale n’était pas à l’aise avec l’utilisation du cidofovir compte tenu de sa toxicité rénale connue; à ce moment-là, le cidofovir était le seul antiviral dont l’activité anti-poxvirus était connue

Figure Vue largeDownload slidePhotomicrographs Microphotographies A & D et E-GA E-GA, faible grossissement montrant une infiltration cutanée dermique dense, un œdème et des vésicules B et intra-épidermiques B, épiderme montrant des cellules multinucléées et de nombreuses inclusions éosinophiles intracytoplasmiques Guarnieri corps flèches C, cellules géantes multinucléées extensives dans l’épiderme D, éosinophiles éminents dans le tissu adipeux sous-cutané E, cellule HEP cultivée provenant de l’inoculation primaire, montrant une flèche intracytoplasmique de type A contenant de nombreuses particules virales matures et en développement bar = micromètres F, nombreuses brique intacytoplasmique flèche de virions en forme de barre de culture cellulaire = nm G, tissu de biopsie récupéré d’un bloc de paraffine montrant des virions intracytoplasmiques classiques échelle de flèches = nmFigure Voir grandTélécharger slidePhotomicrographes H & A; E-GA et microscopie électronique à transmission E-GA, faible grossissement avec dermique dense dans infiltrat inflammatoire, œdème et vésicules sous et intra-épidermiques B, épidermes montrant des cellules multinucléées et de nombreuses inclusions éosinophiles intracytoplasmiques flèches de corps de Guarnieri C, cellules géantes multinucléées étendues dans l’épiderme D, éosinophiles éminents dans le tissu adipeux sous-cutané E, cellules HEP cultivées provenant de l’inoculation primaire , montrant une flèche d’inclusion de type A intracytoplasmique contenant de nombreuses particules virales matures et en développement bar = micromètres F, de nombreuses virions en forme de brique intacytoplasmique en barre d’échelle cellulaire cultivée = nm G, tissu de biopsie récupéré du bloc de paraffine montrant des flèches de virions intracytoplasmiques classiques L’histoire supplémentaire a révélé que le patient n’avait pas voyagé à l’extérieur de sa communauté dans l’État de New York et n’avait pas eu de contact avec des animaux autres qu’un chat sauvage adopté récemment pour un abcès sur le dos. Pour l’analysePar le premier jour de la maladie, le patient n’était pas plus tard, la plaie du flanc droit avait cessé de progresser, aucune nouvelle lésion vésiculeuse ne s’était développée et les lésions existantes avaient guéri. Un débridement final avait lieu le jour de l’hospitalisation et il était sorti quelques jours plus tard. Un suivi à long terme a montré que le patient était bien et sans complication. Des analyses de séquençage subséquentes, utilisant des technologies de prochaine génération, en plus des études pathologiques et virologiques, sont présentées pour caractériser ce nouveau poxvirus. fournir des informations taxonomiques supplémentaires sur ce virus

Méthodes

Clonage d’ADN viral et séquençage d’amplicon de PCR

L’ADN viral purifié a été cloné dans le vecteur pGEM-Z Promega, Wisconsin en suivant les protocoles du fabricant, les fragments d’ADN clonés ont été séquencés et les recherches de similarité de séquence ont été effectuées en utilisant BLAST [ ]

Séquençage génomique à l’aide de plates-formes Illumina

L’ADN viral purifié a été initialement séquencé avec un pyroséquençage à haut débit en utilisant les protocoles standard de la plate-forme Roche GS; Le même ADN extrait viral a été séquencé en utilisant la nouvelle plate-forme Illumina Illumina, Inc., San Diego, Californie. L’assemblage de novo du génome viral a été réalisé en utilisant Cristal de Charcot-Leyden CLC génomique logiciel CLC, Aarhus, Danemark avec une couverture moyenne de Les ensembles de données de séquence ont été comparés pour résoudre les différences entre deux génomes assemblés, en particulier les étirements homopolymériques, en raison de grandes séquences répétitives, ont été remplis en utilisant PCR amplification des régions prédites suivie du séquençage de Sanger des amplicons PCR

Analyse phylogénétique

Neuf séquences codantes AL, AL, AR, DR, DR, HL, ER, EL, et la souche du virus de la vaccine Copenhague Copenhagen VACV-Cop nomenclature , ont été sélectionnés à partir de la région centrale du génome ; ces gènes font partie des gènes conservés à travers les poxvirus Les séquences ont été concaténées et alignées en utilisant l’option d’alignement ClustalW dans Geneious v wwwgeneiouscom / L’analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant le logiciel bayésien v, http: // beastbioedacuk, BEAST, BEAUti et Traceur

RÉSULTATS

Histopathologie et microscopie électronique

De nombreux résultats histologiques dans les tissus débridés ont été constants tout au long de l’évolution de la maladie: un infiltrat inflammatoire dense composé de lymphocytes, histiocytes et éosinophiles; les éosinophiles ont été concentrés dans le derme avec des lobules de tissu adipeux sous-cutané nécrotique et des abcès éosinophiles Des vaisseaux sanguins avec changement fibrinoïde ont également été observés dans les zones de nécrose Des spécimens prélevés après que les vésicules ont développé des vésicules intra-épidermiques remplies de neutrophiles et de lymphocytes; Certaines des vésicules s’étaient rompues et ont été infiltrées d’éosinophiles. Dans un des spécimens, des cellules épithéliales multinucléées ont été observées ainsi que des inclusions cytoplasmiques éosinophiles. Figure Le poxvirus isolé de ce cas, NY_v, a montré des particules de poxvirus classiques dans des inclusions de type A Au sein des cellules cultivées Bien que le tissu récupéré à partir du bloc fixé au formol et inclus en paraffine soit moins bien conservé, EM a montré plusieurs particules de poxvirus classiques.

Études virologiques

Des expériences de neutralisation croisée ont démontré que ce virus n’était pas efficacement neutralisé par un sérum anti-orthopoxvirus groupé provenant de sujets vaccinés et revacciné avec le vaccin antivariolique contre la vaccine alors que la souche WR VACV-WR, un orthopoxvirus eurasien, était efficacement neutralisée. avec des dilutions de sérum groupé à:, ce virus n’a été neutralisé à des dilutions que pour: dilution L’orthopoxvirus nord-américain, le virus du raton laveur, a été neutralisé plus efficacement par ce même sérum groupé à des dilutions allant jusqu’à: Pour caractériser biologiquement ce nouveau poxvirus, son La sensibilité au mycophénolate a été comparée à VACV-WR Alors que la croissance de VACV-WR est complètement inhibée par μM mycophénolate, la croissance de NY_ n’est pas inhibée de plus de% Le IC est approximativement μM pour VACV, et supérieur à μM pour NY_

Séquençage

En utilisant des méthodes de clonage et de séquençage aléatoires, les analyses BLAST ont trouvé que les différentes séquences – nt à partir des extrémités des fragments d ‘ADN viral clonés étaient identiques à% -% aux orthopoxvirus et aux capripoxvirus. Le séquençage subséquent du génome a été séquencé. a révélé un génome viral de nt avec% adénosine et thymidine AT, codant approximativement gènes A chaque extrémité du génome, il y avait des répétitions terminales inversées de nucléotides Aucun gène hémagglutinine HA n’a été identifié, compatible avec la PCR diagnostique négative qui cible cette analyse phylogénétique de séquence, en utilisant des gènes essentiels du poxvirus, indique que ce virus est le plus étroitement apparenté au Yoka poxvirus , qui a été isolé chez des moustiques en République centrafricaine via une enquête écologique Figure; ces virus forment un clade basal aux orthopoxvirus nord-américains et eurasiens

Figure Voir grandDownload slideNY_v noté V est étroitement lié à poxvirus Yoka_DakA Les analyses phylogénétiques ont couru des longueurs de chaîne MCMC avec un GTR et un sites invariants modèles de substitution de taux de nucléotide, paramètres moléculaires strictes et échantillonnage de tous les états L’arbre consensus a été dérivé de l’arbre échantillons Les poxvirus utilisés dans ces analyses sont listés ci-dessous avec leurs numéros d’accession GenBank entre parenthèses: les orthopoxvirus du genre forment des sous-clades, les orthpoxvirus du vieux monde CMLV_M NC_, TATV_DAH NC_, VARV_BGD DQ, VARV_Gar Y, HPXV_MNR DQ, VACV_Cop M, MPXV_LBR DQ, MPXV_COG DQ, CPXV_BR NC_, ECTV_Mos NC_, et orthopoxvirus New World RACV_MD FJ-, SKPV_USA FJ_, VPXV_USA FJ- Poxvirus genre capripoxvirus GTPV_GL AY, LDSV_LW AF, SPPV_TU NC_; Deerpox DPV_W NC_; Suipoxvirus SWPV_Neb NC_; Yatapoxvirus YLDV_Davi NC_ et TANV_KEN NC_; et les léporipoxvirus RFV_Kas NC_ et MYXV_Lau NC_ sont d’autres membres de la sous-famille des chordpoxvirinae Pour enraciner le dendrogramme, les Avipoxvirus CNPV_VR et FWPV_Iowa NC_ et NC_ sont utilisés comme exogroupe La barre d’échelle indique la distance génétique en substitutions par site Abréviations: GTR, temps général réversible; MCMC, chaîne de Markov Monte CarloFigure View largeDownload slideNY_v notée comme V est étroitement liée à poxvirus Yoka_DakA Les analyses phylogénétiques ont couru des longueurs de chaîne MCMC avec un GTR et un sites invariants modèles de substitution de taux de nucléotides, paramètres moléculaires strictes et échantillonnage de tous les états. dérivés des échantillons d’arbres Les poxvirus utilisés dans ces analyses sont listés ci-dessous avec leurs numéros d’accession GenBank entre parenthèses: genre Orthopoxvirus forment des sous-clades, les orthpoxvirus Old World CMLV_M NC_, TATV_DAH NC_, VARV_BGD DQ, VARV_Gar Y, HPXV_MNR DQ, VACV_Cop M, MPXV_LBR DQ, MPXV_COG DQ, CPXV_BR NC_, ECTV_Mos NC_, et New World orthopoxvirus RACV_MD FJ-, SKPV_USA FJ_, VPXV_USA FJ- Poxvirus genre capripoxvirus GTPV_GL AY, LDSV_LW AF, SPPV_TU NC_; Deerpox DPV_W NC_; Suipoxvirus SWPV_Neb NC_; Yatapoxvirus YLDV_Davi NC_ et TANV_KEN NC_; et les léporipoxvirus RFV_Kas NC_ et MYXV_Lau NC_ sont d’autres membres de la sous-famille des chordpoxvirinae Pour enraciner le dendrogramme, les Avipoxvirus CNPV_VR et FWPV_Iowa NC_ et NC_ sont utilisés comme exogroupe La barre d’échelle indique la distance génétique en substitutions par site Abréviations: GTR, temps général réversible; MCMC, chaîne de Markov Monte CarloLe virus NY_v contient un gène ATI d’inclusion de type A, de la même taille que celui exprimé par ectromelia l’agent causal de mousepox et compatible avec les corps d’inclusion de type A observés par EM NY_v contient également des ORF non annotés précédemment Il est intéressant de noter que le nouveau virus code les homologues de l’antigène du CMH de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité, qui génèrent les meilleurs scores de similarité avec les antigènes du CMH de classe I. Une analyse plus poussée des fonctions de ces gènes pourrait nous aider à comprendre hôte

DISCUSSION

Une combinaison d’approches diagnostiques classiques et novatrices a été nécessaire pour caractériser ce pathogène. L’histopathologie des tissus infectés a révélé des inclusions du poxvirus de type B rarement reconnues dans les corps de Guarnieri tels que rapportés chez la variole , le fowlpox et le tanapox . Bien que les technologies de séquençage de nouvelle génération n’étaient pas disponibles au moment de l’identification initiale de ce cas, ce rapport démontre leur utilité dans l’identification de nouveaux agents pathogènes humains. limitations des diagnostics de PCR qui ciblent de petites régions, typiquement <%, d'un génome de poxvirus pour déterminer les espèces de poxvirus Ni l'hémagglutinine standard standard ni les diagnostics de PCR ATI étaient informatifs en raison de l'absence d'hémagglutinine dans NY_ et de mésappariements de nucléotides dans les sites de recuit des jeux d'amorces ATIThe poxv la famille de l'irus englobe une gamme d'espèces de virus qui infectent les vertébrés et les insectes; les virus sont des virus à ADN double brin complexes qui se répliquent dans le cytoplasme de la cellule hôte. Avant ce rapport, des virus, des parapoxvirus, des molluscipoxvirus, des yatapoxvirus et des orthopoxvirus étaient connus pour infecter les humains. Parmi les orthopoxvirus, la plupart sont des infections zoonotiques. L'homme, à l'exception du virus variolique, agent causal de la variole La similitude antigénique entre les membres d'une espèce a permis de reconnaître qu'une infection par un membre moins virulent de l'espèce pourrait protéger contre un membre plus virulent du genre orthopoxvirus. Les virus de la vaccine ont été utilisés comme vaccins à virus vivant contre la variole. La vaccination de routine contre la variole a cessé au début de l'éradication de la variole. On a noté un nombre croissant d'infections humaines avec d'autres orthopoxvirus: vaccine, cowpox, et le monkeypox ont tous été notés en tant qu'organismes pathogènes en réapparition ou émergents de l'orthopoxvirus. L'oxvirus est unique et est un agent pathogène humain antérieurement méconnu. Sa caractérisation phylogénétique indique qu'il est le plus étroitement lié au pyvirus Yoka récemment décrit. Les différences entre ces virus incluent la présence ou l'absence d'inclusions de type A NY_v forme des corps d'inclusion de type A, alors que Yoka poxvirus une grande troncation à l'extrémité du gène ATI; aucune structure d'ATI n'a été observée pendant la croissance de Yoka poxvirus Ce virus, associé au virus Yoka, devrait probablement être désigné comme appartenant à un nouveau genre de poxvirus partageant un ancêtre commun des orthopoxvirus. La divergence de la séquence du génome NY_ explique l'utilisation infructueuse initiale de l'orthopoxvirus. diagnostics ciblant les gènes ATI et hémagglutinine et d'autres tests standards Récemment, un nouveau test PCR PCR pan guanine-guanine-cytosine a été développé qui permet d'amplifier et de séquencer plusieurs autres chordopoxvirus hautement divergents. Les propriétés antigéniques de ce virus ont été évaluées. par des expériences de neutralisation croisée avec des sérums anti-vaccinaux, comparés aux orthopoxvirus eurasiens et nord-américains, indiquent la ressemblance éloignée de NY_v aux membres du genre orthopoxvirus. Cet individu a l'âge d'avoir été vacciné contre la variole dans son enfance; les données de neutralisation croisée fournies ici suggèrent que le vaccin antivariolique peut fournir peu de protection contre ce nouveau poxvirus. Le syndrome d'Alport n'est pas connu pour rendre les individus plus sensibles aux infections à poxvirus, mais l'immunosuppression a été associée à des infections à poxvirus plus graves. identifié dans une collection historique de bassins de moustiques à partir d'enquêtes écologiques effectuées en Afrique subsaharienne, et la collection qui a révélé que le virus Yoka a été obtenu en République centrafricaine a été identifiée en Amérique du Nord. l'écologie de ces virus sera importante pour des raisons de santé publique Ce cas sert également à rappeler que les patients sous immunosuppresseurs sont sujets à de nouvelles maladies infectieuses zoonotiques.

Remarques

Remerciements Nous remercions Nadine Bartholoma qui a fait les premières isolations virales, Maureen Barcza a pris les images de microscopie électronique à transmission, le laboratoire de Wadsworth pour la microscopie électronique confirmatoire et les tests d’entérovirus, et Miriam Laker qui a effectué certaines des analyses initiales de clonage et d’explosion. Centre de contrôle et de prévention des maladies CDC pour l’aide au séquençage, et Dhwani Batra pour l’assistance au montage initial et aux analysesDisclaimer Les constatations et les conclusions de ce rapport sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle du soutien financier du CDCF. fourni par les institutions d’origine de l’auteur Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêt potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués