Opsonisation du streptocoque du groupe A du TM: Dynamique de la production d’anticorps et de la spécificité de la souche

Une méthode de chimiluminescence a été utilisée pour étudier l’opsonisation du streptocoque du groupe A du sérotype TM dans des sérums prélevés sur des sérums prélevés chez des patients suédois atteints d’une infection invasive et non invasive du sang et de donneurs de sang sains. pour opsoniser le propre isolat de SGA du patient, indépendamment de la manifestation clinique Seulement ~% des échantillons de sérum obtenus de donneurs de sang sains ont démontré une activité opsonique élevée contre une souche TM standardisée. ceci indique qu’une immunité opsonique élevée peut se développer seulement contre l’isolat infectant ou des clones identiques. Les TM GAS isolés à partir de travers étaient mieux opsonisés par l’échantillon de sérum immun que les isolats obtenus avant ou après, une découverte qui suggère un changement temporel des propriétés de surface qui affectent opsonisation

Les caractéristiques cliniques et épidémiologiques des infections invasives dues au streptocoque du groupe A ont changé depuis le milieu de l’année. Un nombre accru d’épisodes sévères, souvent dus à une infection de la peau ou des tissus mous et évoluant en état de choc ont été notés et classés comme syndrome de choc toxique streptococcique STSS GAS du sérotype M ou M qui portent le gène speA de l’exotoxine A pyrogène streptococcique codée par le phage ont été isolés chez un grand nombre de patients présentant des manifestations sévères Cette toxine est un superantigène puissant et est impliqué comme un facteur important dans la pathogenèse de STSS Plusieurs autres superantigènes peuvent être produits par des isolats de GAS qui causent une maladie invasive, mais leur association avec STSS reste incertaine En Suède, il y a eu des épidémies de les infections invasives à SGA causées par des isolats M porteurs du gène spAA; En outre, les infections non invasives qui sont survenues au cours des mêmes périodes ont également été causées principalement par des isolats M de clones identiques ou très proches Dans l’intervalle de temps entre ces épidémies, l’incidence Les raisons de ces cycles épidémiques d’infection M dans la population ne sont pas claires. On pense que l’immunité protectrice contre l’infection à GAS est acquise par le développement d’anticorps opsonisants dirigés contre la partie N-terminale hypervariable spécifique à la protéine M , qui est un déterminant majeur de la virulence du SGA Par conséquent, le développement de l’immunité collective contre les épitopes M aurait dû prévenir la seconde épidémie de M infections en Suède. immunité acquise non efficace En outre, perte de l’immunité acquise ou augmentation de la population indind En particulier, les enfants peuvent influencer le modèle épidémique Depuis l’étude précoce de Lancefield , la capacité des sérums «sérums» pour l’opsonisation des isolats GAS a été analysée principalement dans des études expérimentales À notre connaissance, peu de patients- Les études classiques d’opsonisation impliquent des tests bactéricides directs ou indirects, qui demandent du temps et du travail. Cependant, de nouvelles techniques de mesure de l’opsonisation du GAS, telles que la cytométrie de flux et la chimiluminescence , ont été développé; Ces nouvelles techniques permettront d’effectuer des études plus importantes. Le but de cette étude était de déterminer, pour les sérums obtenus à partir de patients présentant différentes manifestations cliniques d’infections à TM GAS, la capacité d’opsonisation de leurs propres isolats infectieux; la capacité d’opsonisation d’une souche M standard a également été déterminée pour des sérums prélevés sur des donneurs de sang sains. En outre, nous avons étudié la possibilité d’une dérive antigénique majeure récente en comparant la sensibilité opsonique à un seul échantillon immunologique de M de différentes périodes pendant –

Matériaux et méthodes

Des sérums en phase aiguë et des sérums en phase de convalescence « sérums aigus » et « sérums de convalescence », obtenus respectivement à partir des patients sus-mentionnés infectés par des streptocoques, ont été utilisés. utilisé pour opsoniser l’isolat homologue Tous les sérums aigus ont été obtenus dans les jours suivant l’admission des patients à l’hôpital pour le traitement de la maladie ou, pour les patients amygdalites, le jour de la visite au service ambulatoire. Des sérums aigus et convalescents, ainsi que des sérums simples et convalescents simples, ont été obtenus chez des patients atteints d’érysipèle. Des sérums aigus étaient disponibles chez des patients atteints d’une maladie invasive dont les échantillons de sang en culture donnaient GAS. Pour le patient, pour qui nous manquions l’isolat homologue, l’échantillon de sérum était s ont été analysés par rapport à un autre isolat TM GAS obtenu la même année chez un patient dans la même zone géographique. Des sérums convalescents Umeå étaient disponibles chez les patients. Neuf sérums aigus et convalescents appariés étaient disponibles chez les patients présentant une amygdalite. le sérotype T, et les autres isolats étaient le sérotype TM. Les sérums ont été obtenus chez des hommes et des femmes avec un érysipèle d’âge moyen, des années; tranche d’âge, – ans, d’hommes et de femmes atteints de bactériémie âge moyen, années; tranche d’âge, – années, et des hommes et des femmes atteints d’amygdalite âge moyen, années; tranche d’âge, – annéesSera obtenus à partir de donneurs de sang en santé ont été analysés pour l’activité opsonique contre une seule souche standard de GAS TM /; obtenus du laboratoire du Dr DL Stevens, Centre Médical des Anciens Combattants, Boise, Idaho. Les sérums ont été prélevés chez des hommes ayant une moyenne d’âge de quelques années, des années et des femmes avec un âge moyen d’années, – enfin, un seul convalescent. Un sérum immun avec une activité bactéricide significative connue contre sa souche homologue M GAS a été utilisé pour quantifier l’anticorps opsonique contre les différents isolats de TM GAS. Tous les sérums ont été maintenus à – ° C ou – ° C jusqu’à leur utilisation Tous ont été soumis à une inactivation thermique à Le complément de cobaye Sigma a ensuite été ajouté en excès de μL par échantillon pour s’assurer qu’il y avait une quantité adéquate de complément dans chaque échantillon de sérum. Test de chimiluminescence Les isolats de GAS ont été maintenus à – ° C ou – ° C, et le nombre de sous-cultures a été maintenu minimum avant que le test d’opsonisation ne soit effectué. Des bactéries ont été cultivées dans du bouillon Todd-Hewitt plus du% de néopentone THPN; Difco pour h à ° C en% CO Dix pour cent de la culture en phase stationnaire ont été utilisés pour inoculer du THBN frais préchauffé, qui a ensuite été incubé à h ° C en% CO, en agitant, pour obtenir une culture en phase logarithmique. Le culot bactérien a été lavé deux fois avec du PBS glacé et a été remis en suspension dans des mL de PBS Chaque suspension de culture -mL a été chauffée à ° C pendant h pour tuer la bactériePour la préparation des phagocytes, du sang total de un donneur sain a été obtenu par l’utilisation de tubes EDTA, agités avec un léger mouvement à température ambiante, et utilisé dans -min. Pour standardiser les résultats entre les différents essais, des numérations leucocytaires et différentielles ont été effectuées. les résultats sont exprimés en nombre de coups par minute par phagocyte cpm / phagocyte. L’opsonisation a été réalisée comme décrit ailleurs En bref, μL de bactéries tuées par la chaleur A nm = a été mélangé avec μL de dilution du sérum, en% de sérum physiologique Après incubation, les échantillons ont été lavés avec du PBS et centrifugés, et le surnageant a été déchargé. Le culot bactérien a été remis en suspension dans des pL de PBS, et un ul de luminol Sigma a été ajouté. Les échantillons ont été placés dans la machine de chimiluminescence. et après min pour l’équilibrage de la température, on a injecté automatiquement dans chaque échantillon μL de sang total dilué dans des mL de milieu de dilution du sang préchauffé Le système a été maintenu à ° C et les mesures ont été faites toutes les minutes. un échantillon de sérum normal incubé avec une souche TM GAS était le témoin négatif; un échantillon de sérum anti-TM convalescent avec une activité bactéricide élevée connue dans le test bactéricide indirect , incubé avec la souche M standard, était le témoin positif; et un μL de zymozan opsonisé par complément était un contrôle de la compétence phagocytaire des leucocytes. Un standard de photon était utilisé pour standardiser les dosages entre essais. Les résultats d’opsonisation pour des sérums spécifiques sont exprimés comme la valeur cumulée moyenne moyenne de cpm / phagocyte dans des analyses en double. dans l’activité opsonique entre les sérums aigus et les sérums convalescents dans les catégories de patients ont été analysés par l’utilisation de tests t appariés et le test de rang signé de Wilcoxon Les variables catégoriques ont été analysées en utilisant le test exact de Fisher

Résultats

Activité opsonique des sérums aigus et convalescents chez les patients atteints d’infections à M GAS Les valeurs de chimiluminescence pour l’échantillon de sérum contrôle négatif étaient – cpm / phagocyte, et celles pour l’échantillon de sérum contrôle positif étaient – cpm / phagocyteL’activité opsonique moyenne dans les sérums aigus des patients avec érysipèle était la cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; intervalle, – cpm / phagocyte Trois sérums ont montré une activité élevée qui était dans la même gamme que celle de l’échantillon de sérum témoin positif. L’activité d’opsonisation moyenne dans les sérums de convalescence était cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; intervalle, – cpm / phagocyte In des sérums appariés, il y avait une plage d’augmentation, – cpm / phagocyte dans l’activité opsonique contre l’isolat homologue respectif pendant la convalescence Un échantillon de sérum aigu d’un patient avait une valeur élevée d’opsonisation cpm / phagocyte, mais la valeur était plus faible pour l’échantillon de sérum de convalescence cpm / phagocyte L’augmentation de l’activité opsonique entre le moment où les sérums ont été obtenus et le moment où les sérums de convalescence ont été obtenus n’était pas statistiquement significative. par Wilcoxon’s test-rank, dans une comparaison des sérums aigus et convalescents de patients atteints d’érysipèle

Figure Vue détailléeDétecteur de l’activité opsonique dans les échantillons sériques de phase aiguë «sérums aigus» et échantillons de sérum en phase de convalescence «sérums convalescents» de patients atteints d’érysipèle, de bactériémie ou d’amygdalite, après opsonisation de leur propre isolat TM infectant; l’activité opsonique est mesurée par la chimiluminescence en coups par minute cpm par phagocyte Seuls les sérums de convalescence étaient disponibles chez les patients présentant une bactériémie; ceux-ci ne sont pas montrés sur la figure. Les sérums des donneurs de sang suédois ont été utilisés pour opsoniser une souche standard M / Les points montrent des valeurs individuelles pour les sérums individuels Les barres verticales indiquent la moyenne et SE pour des sérums particuliers, selon le groupe de patients. des échantillons de sérum de phase « sérums aigus » et des échantillons de sérum en phase de convalescence « sérums de convalescence » provenant de patients atteints d’érysipèle, de bactériémie ou d’amygdalite, après opsonisation de leur propre isolat TM infectant; l’activité opsonique est mesurée par la chimiluminescence en coups par minute cpm par phagocyte Seuls les sérums de convalescence étaient disponibles chez les patients présentant une bactériémie; ceux-ci ne sont pas montrés sur la figure Sérums de donneurs de sang suédois utilisés pour opsoniser une souche standard M / Dots montrent des valeurs pour des sérums individuels Les barres verticales montrent la moyenne et SE pour des sérums particuliers, selon le groupe de patients Activité opsonique dans les sérums aigus de patients atteints de bactériémie était généralement faible La valeur moyenne était cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; – Le cpm / phagocyte Deux sérums aigus ont démontré une activité opsonique étonnamment élevée et un cpm / phagocyte, respectivement. Le premier échantillon de sérum aigu a été obtenu chez un homme âgé de 6 ans présentant une maladie cardiovasculaire et une ostéite de la main. Il a été admis à l’hôpital après seulement quelques jours de maladie, et l’échantillon de sang pour la culture et l’échantillon de sérum ont été prélevés ce jour-là. Le deuxième échantillon de sérum a été prélevé chez un homme déjà en bonne santé admis à l’hôpital. Après une semaine de maladie avec fièvre basse et gonflement des glandes cervicales La veille de son admission, il a développé une forte fièvre, une cellulite du cou et une détresse respiratoire. Il a été observé du jour au lendemain à l’unité de soins intensifs en raison d’une suspicion d’épiglottite. La maladie aiguë de ce patient a débuté au moins une semaine avant l’admission et peut avoir contribué au titre élevé d’anticorps opsonique qui s’était déjà développé au lendemain de l’admi ssion, lorsque l’échantillon de sérum a été obtenu Seuls les sérums de convalescence étaient disponibles chez les patients présentant une bactériémie; L’activité opsonique de ces sérums convalescents a été modérément augmentée par cpm / phagocyte. Les sérums appariés de nine des patients atteints d’amygdalite ont été étudiés. L’activité opsonique moyenne dans les sérums aigus était de cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; intervalle, – cpm / phagocyte Seuls les sérums aigus présentaient une activité opsonique élevée cpm / phagocyte Dans les sérums convalescents, l’activité opsonique moyenne était cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; – Sept cpm / phagocyte Sept des sérums convalescents ont montré une activité opsonique peu ou pas augmentée, alors que dans ces sérums, une augmentation substantielle a été notée P =, par test t apparié, et P =, par le test de Wilcoxon, dans une comparaison des sérums aigus et convalescents des patients atteints d’amygdalite. Les sérums convalescents des patients atteints d’amygdalite étaient habituellement obtenus ~ semaines, des jours après l’obtention des sérums aigus, alors que l’intervalle moyen avant les sérums convalescents était obtenu chez les patients avec érysipèle. Les sérums convalescents des patients atteints d’érysipèle ont généralement montré un niveau plus élevé d’activité opsonisante que ceux des patients atteints d’amygdalite. Nous avons donc analysé l’augmentation de l’activité opsonique liée aux intervalles entre les temps où tous les sérums aigus et convalescents chiffre obtenu

Figure Augmenter, par le temps, dans l’activité opsonique des phagocytes après opsonisation des isolats de TM dans tous les échantillons de sérum en phase aiguë et en phase de convalescence appariés de patients, comme dans la figure. phagocytes après opsonisation des isolats de TM dans tous les échantillons de sérum en phase aiguë et convalescents appariés des patients, comme dans la figure L’activité opsonique a augmenté de manière significative avec le temps Données pour le patient qui a montré une activité opsonique élevée dans l’échantillon de sérum aigu cpm / phagocyte et considérablement Les données sur l’échantillon sérique ont été obtenues quelques jours après l’obtention de l’échantillon de sérum aigu. L’activité opsonique contre la souche M GAS / dans les sérums de donneurs de sang sains L’activité opsonique moyenne dans les sérums de donneurs de sang en bonne santé était la cpm / phagocyte médiane, cpm / phagocyte; gamme, – cpm / phagocyte; Il n’y avait pas de différence significative entre le titre opsonique moyen dans les sérums prélevés sur des donneurs sains et dans les sérums aigus prélevés chez des patients atteints d’amygdalite, de bactériémie ou d’érysipèle. qui a été obtenu à partir d’un donneur américain qui avait une infection TM et qui était connu pour avoir une activité bactéricide élevée contre son isolat homologue a été utilisé pour opsoniser les isolats TM suédois L’activité opsonique de cet échantillon de sérum contre les isolats TM suédois variait considérablement , – cpm / phagocyte; moyenne, cpm / phagocyte; La capacité de cet échantillon de sérum à opsoniser ces isolats était généralement bien meilleure que celle observée pour les sérums aigus – ainsi que pour de nombreux sérums convalescents – provenant de patients atteints d’érysipèle, de bactériémie ou d’amygdalite. d’origines géographiques différentes, sites d’isolement sang, voies respiratoires, etc, ou types cliniques d’infection Cependant, les souches semblaient constituer des groupes

Figure Vue largeDownload slideDistribution de l’activité opsonique des phagocytes contre différents isolats de TM suédois de la période -, quand opsonisé par un échantillon de sérum immun uniqueFigure View largeDownload slideDistribution de l’activité opsonique des phagocytes contre différents isolats de TM suédois de la période -, opsonisé par un seul Echantillon de sérum immun Un groupe d’isolats peu opsonisés et un second groupe plus fortement opsonisé ont semblé diverger à ~ cpm / nombre de phagocytes. Sur la base de cette observation, les isolats ont été arbitrairement divisés en groupes, qui ont été désignés comme « élevés ». « Et les groupes » bas « . Il est intéressant de noter qu’il y avait une plus grande proportion d’isolats hautement sensibles de la période – que des autres périodes P =, pour la comparaison des isolats de – avec des isolats de -, et P =, pour comparaison d’isolats de – avec des isolats de – [par le test exact de Fisher]; figure

Figure Vue largeDownload de distribution d’isolats TM suédois de différentes périodes, montrant une susceptibilité élevée et faible à l’opsonisation par un seul échantillon de sérum immun Voir le texte pour les explicationsFigure View largeDownload slideDistribution d’isolats TM suédois de différentes périodes, montrant une susceptibilité élevée et faible à l’opsonisation un seul échantillon de sérum immun Voir le texte pour les explications

Discussion

L’activité opsonique était faible, mais aucune différence majeure n’a été notée dans la comparaison de la capacité opsonisante des sérums des patients atteints de bactériémie avec celle des sérums des patients atteints d’érysipèle ou d’amygdalite mais sans bactériémie. Ceci indique que des facteurs supplémentaires contribuent au développement de Dans tous les groupes de patients, quelques sérums aigus présentaient un titre opsonique élevé. Ceci est quelque peu surprenant, en particulier chez les patients atteints de bactériémie polyarthrite rhumatoïde. Un des patients atteints de bactériémie qui avait un titre élevé d’opsonisation avait été malade pendant une semaine avant l’admission, qui a pu être un délai suffisant pour l’induction d’une réponse anticorps. Cependant, le patient présentait encore une bactériémie lorsque les sérums aigus ont été prélevés. Pour l’autre patient, cependant, aucune explication n’a pu être trouvéeRelativement peu de sérums convalescents étaient disponibles, mais une augmentation dans la capacité d’opsonisation après l’infection clinique de GAS développé relativement lentement au cours de quelques semaines Ceci est con Il a été noté tôt que le traitement antibiotique pourrait réduire le développement d’anticorps opsonisants après une infection streptococcique [,,] si cela était un facteur important dans la réduction de l’induction des anticorps opsonisants dans notre étude. L’augmentation du titre d’opsonisation était plus faible chez les patients atteints d’amygdalite que chez ceux atteints d’érysipèle. Ceci peut être lié aux différences cliniques et physiopathologiques entre ces maladies ou, peut-être, à la différence de temps entre l’échantillonnage des sérums aigus et des sérums de convalescence dans les groupes, l’intervalle était environ deux fois plus long pour le groupe avec érysipèle. Pour les isolats de GAS en Suède, l’opsonisation par l’échantillon unique de sérum immun présentait une variabilité considérable. Un grand nombre d’isolats de TM GAS provenant de patients en Amérique du Nord ont révélé Variabilité de l’activité opsonique Par conséquent, il semble que l’immunité opsonique acquise contre une souche M spécifique peut être limitée aux isolats qui causent l’infection ou à ceux qui sont très étroitement liés Une étude précédente a produit des résultats similaires cette étude a déjà été analysée au moyen d’électrophorèse sur gel à champ pulsé et de la présence du gène spA, et ils se sont révélés identiques à ces égards Par conséquent, le mécanisme sous-jacent de variation de la sensibilité à l’opsonisation des isolats est inconnu. étude complémentaire Dans la présente étude, la proportion d’isolats de GAS TM sensibles à l’opsonisation par un échantillon de sérum immun était plus élevée parmi les isolats récupérés pendant – que parmi ceux retrouvés avant et après cette période. Il a été montré que les mutations ponctuelles et les insertions à petite échelle dans le gène emm donne naissance à des variants de la protéine M avec des epitopes immunitaires modifiés Avec le temps, cela peut générer e TM isolats ayant une sensibilité différente à l’opsonisation par un échantillon de sérum spécifique Par conséquent, une dérive de changement dans les propriétés de surface qui affectent la susceptibilité à l’opsonisation de certains isolats de MT peut avoir eu lieu au milieu de cette période. En conclusion, l’activité d’opsonisation dans les sérums aigus provenant de patients souffrant d’érysipèle, de bactériémie ou d’amygdalite était faible par rapport à leur propre isolat de TM GAS infectant. Les sérums de convalescence présentaient une activité opsonique plus élevée, mais plusieurs semaines semblaient être L’activité opsonique était plus élevée dans les sérums convalescents des patients atteints d’érysipèle que dans les sérums des patients atteints d’amygdalite. Cela peut refléter une véritable différence dans la dynamique de la production d’anticorps, ou simplement être lié à l’intervalle plus long entre l’échantillonnage des sérums aigus et convalescents chez les patients atteints d’érysipèle Sérums de santé Les donneurs de sang ont généralement montré des niveaux légèrement plus élevés d’activité d’opsonisation, mais seulement ~% ont démontré une activité élevée; cette constatation reflète peut-être un faible niveau moyen d’immunité dans la population adulte relativement jeune. Pour les isolats de GAS TM récupérés pendant -, il y avait une variation considérable de la sensibilité à un seul échantillon de sérum immun, et une immunité opsonique élevée peut être limitée à l’infection. isolats ou clones identiques Les isolats de GAS récupérés au cours des dernières années étaient souvent plus sensibles à l’opsonisation par cet échantillon de sérum; cette découverte suggère que la seconde épidémie d’infection M chez les patients en Suède pourrait être liée, en partie, à l’acquisition ou à l’altération récente de composants de surface qui rendent les souches M résistantes à l’opsonisation en présence d’anticorps opsoniques spécifiques de type Des études détaillées pour déterminer le mécanisme moléculaire de cette résistance sont nécessaires pour expliquer l’épidémiologie unique des infections à MAS en Suède |

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